WA. 0812-9318-5185 | Isolasi DNA dan RNA untuk PCR

Inti sel merupakan komponen dalam sel terpenting yang banyak menyimpan banyak informasi genetik. Informasi genetik ini disusun oleh nukleotida yang ada di dalam inti sel. Nukleotida terdiri dari asam nukleat, yaitu yang paling umum Asam deoksiribonukleat (DNA) dan Asam ribonukleat (RNA). DNA memiliki rantai asam nukleat ganda (double helix) sedangkan RNA hanya memiliki 1 rantai asam nukleat pendek. Asam nukleat ditemukan di semua sel makhluk hidup dan virus. Isolasi asam nukleat merupakan salah satu teknik dasar biologi molekuler yang digunakan untuk mengetahui ekspresi suatu gen. 

Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher pada tahun 1869, untuk mengisolasi sel darah putih. Isolasi Asam deoksiribonukleat (DNA) dan Asam ribonukleat atau RNA meliputi serangkaian proses yaitu proses Lisis, Ekstraksi, Pemurnian, dan Presipitasi. Bedanya dengan DNA, Isolasi RNA tidak membutuhkan enzim RNase karena dapat mendenuturasi atau merusak RNA. 

Berikut deskripsi dari Proses Isolasi Asam Nukleat (DNA & RNA)

1. Proses Lisis

Proses lisis merupakan proses memecahkan membran sel guna mengeluarkan isi dalam sel. Proses lisis biasanya dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:

• Mekanik: proses lisis dengan mekanik biasanya dilakukan dengan menggerus sampel menggunakan mortar dan pestle, adapun dengan teknik iradiasi, sonikasi dan tekanan tinggi. 

Brand	Cat no	Description	Pack
Allsheng	Bioprep-24	Bioprep24	1unit
Biofil	CSP001002	Pestles for 1.5ML Micro Centrifuge Tube	1unit

Untuk sampel dalam jumlah sedikit biasanya cukup dengan menggunakan mortar dan pestle seperti gambar berikut. Ideal digunakan untuk resuspensi protein dan DNA serta menggerus jaringan lunak.

a. Mortar dan pestle	b. Bioprep24
Gambar 1. Proses lisis secara mekanik

Bioprep-24 adalah solusi bagi Anda untuk preparasi sampel dan lisis sel dengan jumlah sample yang banyak. Homogenizer yang andal, cepat, dan berkinerja tinggi untuk mengekstrak DNA, RNA atau protein dari hewan, jaringan manusia dan tumbuhan, mikro-organisme, spora, tulang, dll.

• Kimiawi dan Enzimatis: Bahan kimia untuk proses lisis menggunakan detergen, SDS (sodium dodecyl sulfate), CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) atau menggunakan lysis buffer untuk melarutkan lipid pada membran sel. Sedangkan proses enzimatik menggunakan enzim proteinase K.

Brand	Cat no	Description	Pack
Sangon	A100227-0100 A100227-0500	SDS (sodium dodecyl sulfate), Molecular Biology Grade  CAS : [151-21-3]	100G 500G
Sangon	A600108-0100 A600108-0500	CTAB, Cetyltrimethylammonium bromide CAS : [57-09-0]	100G 500G
Elabscience	E-IR-R109	proteinase K	1ml, 5ml, 10ml

2. Proses Ekstraksi dan Pemurnian/Presipitasi Asam Nukleat

Proses Ekstraksi dilakukan guna memisahkan komponen lain selain asam nukleat (DNA/RNA). Ada cara manual dan otomatis:

• Cara Manual

Cara manual untuk ekstraksi DNA ada yang menggunakan bahan Organik dan ada juga secara konvensional menggunakan reagen kimia serta spin column. 

1. Ekstraksi, Pemurnian/Presipitasi DNA & RNA dengan Pelarut Organik

Pada proses ekstraksi DNA ini seringkali membutuhkan chelating agent seperti EDTA untuk menginaktivasi DNAse agar tidak terdenaturasi. Kemudian ditambahkan fenol untuk mendenaturasi protein dalam sel setelah itu disentrifugasi dan terjadi presipitasi membentuk 3 layer, yaitu fase organik (lapisan bawah) terdiri dari komponen organik; fase tengah (interfase) terdiri dari komponen protein dan gDNA; dan fase air (aqueous phase) terdapat RNA. Untuk memurnikan RNA diperlukan lagi pelarut organik seperti alkohol dan dilakukan kembali sentrifugasi.

2. Ekstraksi, Pemurnian/Presipitasi DNA & RNA dengan Reagen Kimia

Sekarang sudah banyak reagen konvensional untuk ekstraksi DNA dan RNA. Ada reagen dari Thermo yaitu Trizol, juga ada Reagen Tripure ready stock di Perusahaan kami. Pada dasarnya proses ekstraksi dengan reagen ini sama prinsipnya yaitu mengendapkan komponen sel selain DNA atau RNA. 

Brand	Cat no	Description	Pack
Indogen	ATB2700	TRIpure Reagent (For Total RNA Isolation)	50ml

Tripure adalah reagen khusus untuk mengisolasi RNA baik dari tanaman, yeast, bakteri maupun dari virus. Tripure reagent digunakan pada sampel yang sudah dilisis sebelumnya. Proses penggunaan TRipure lebih detailnya dapat dilihat pada sheet Data manual Tripure. Penggunaan Reagen Tripure atau Trizol dapat meminimalisir adanya kontaminasi DNA atau protein sel lainnya, dan Reagen ini cocok untuk aplikasi downstream RT-PCR, Northern blot, dot blot, seleksi poli (A)+, dan Translasi secara in vitro lainnya.

3. Ekstraksi, Pemurnian/Presipitasi DNA & RNA dengan Spin Column

Spin column merupakan teknik pemurnian asam nukleat menggunakan membran yang biasanya berbahan silika, serat kaca, atau membran pertukaran ion. Prinsipnya asam nukleat akan berikatan dengan membran silika saat dilalui oleh sampel yang sudah dicampur dengan larutan pengikat. Larutan pengikat yang biasanya digunakan yaitu larutan buffer, etanol atau isopropanol. Selanjutkan akan dimasukkan ke dalam spin column (wadah khusus berbahan plastik) bersamaan dengan sampel yang sudah melalui tahap lisis dan dilakukan sentrifugasi. Asam nukleat yang sudah terikat pada membran akan melewati proses pencucian dan elusi menggunakan larutan buffer. 

• Cara Otomatis

Cara otomatis dapat dengan menggunakan alat magnetic beads atau magnetic particles (0.5–1µm). Prinsip kerja magnetic beads ini memisahkan partikel RNA target dengan adanya medan magnet yang telah sebelumnya telah berikatan dengan partikel paramagnetik yang diinginkan. Paramagnetik adalah bahan yang dapat ditarik kuat dengan magnet. 

Sumber:

1. https://www.thermofisher.com/id/en/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/general-articles/the-basics-rna-isolation.html

2. https://indogen.id/tripure-isolation-reagent/ 

3. https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification 

Subscribe to receive free email updates: