WA. 0812-9318-5185 | Teori, Teknik dan Penangan pada Western Blot

1. Pendahuluan

Western blot merupakan teknik yang sangat penting dalam ilmu biologi sel atau biologi molekuler. Para peneliti menggunakan teknik western blot sebagai cara untuk identifikasi spesifik protein dari ekstrak protein yang bercampur. Teknik western blot terdiri dari 3 tahapan, yaitu pemisahan molekul protein berdasarkan ukuran, transfer ke bahan padatan, dan menandai target menggunakan antibodi primer dan sekunder sebagai visualisasi.

Pemisahan protein berdasarkan berat molekulnya dan berat jenisnya dilakukan dengan gel elektroforesis. Elektroforesis adalah pemisahan protein berdasarkan pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Kemudian molekul-molekul tersebut akan ditransfer ke membran membentuk pita masing-masing protein. Membran tersebut kemudian diinkubasi dengan memberikan label antibodi target protein yang diinginkan.

Protein target akan berikatan dengan antibodi. Pada tahap pencucian membran, antibodi yang tidak terikat akan lepas dan hanya meninggalkan antibodi yang berikatan dengan protein target. Protein yang berikatan dengan antibodi akan menunjukan pita yang tebal dan dapat ditentukan jumlah proteinnya berdasarkan standar atau marker protein yang telah tersedia. 

2. Teknik Western Blot

Yang perlu diperhatikan dalam teknik western blot yaitu Ektraksi sampel protein, persiapan gel, proses elektroforesis, proses transfer protein pada membran, proses bloking dan penempelan antibodi. Berikut akan dipaparkan secara rinci untuk tahapan pada teknik Western Blot.

1. Ekstraksi Protein

Protein dapat diperoleh dari ekstrak kultur sel dan jaringan. Untuk mengoptimalkan proses ekstraksi protein yang berasal dari kultur sel dan jaringan (sel adherent) dapat dilakukan beberapa tahap sebagai berikut:

1.1 Cuci sel dalam wadah kultur menggunakan PBS (phosphate buffered saline) dingin dan goyangkan perlahan. Kemudian buang PBS dan letakkan wadah yang berisi sel di atas es.

1.2 Tambahkan PBS dan gunakan cell scraper untuk melepaskan sel dari wadah. Gunakan mikropipet untuk memindahkan suspensi sel ke dalam tabung sentrifuge.

1.3 Lakukan sentrifugasi sampel sel pada kecepatan 1500rpm selama 5 menit kemudian buang supernatan.

1.4 Tambahkan lysis buffer sebanyak 180μl dan 20μl koktail protease inhibitor dingin. (Tips: jika konsentrasi tidak cukup tinggi, ulangi tahapan ini dengan menambahkan koktail protease inhibitor).

1.5 Diamkan sampel sel selama 30 menit dalam kondisi dingin (di atas es), kemudian disentrifuge dengan kecepatan 12000rpm, pada suhu 4℃ selama 10 menit.

1.6 Pindahkan supernatan ke tabung baru lalu simpan sampel pada suhu dingin atau beku di -20 atau -80℃.

1.7 Ukur konsentrasi protein menggunakan spektrofotometer.

2. Persiapan Gel Elektroforesis (SDS-PAGE)

Gel yang akan digunakan untuk proses elektroforesis atau SDS-PAGE merupakan gel poliakrilamid yang terdiri dari gel pemisah atau separation gel dan stacking gel. Separation gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak di bagian bawah alat. Separation gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan sampel). 

Separtion gel harus disesuaikan dengan berat molekul protein target, berikut adalah konsentrasi gel untuk beberapa berat molekul protein.

Konsentrasi separation gel(%)	Berat molekul protein (kDa)
6%	>140
8%	100-140
10%	30-100
15%	10-30
20%	<10

Bahan pembuatan gel SDS-PAGE terdiri dari 30% Acrylamide/Bis Solution (30% Acr Bis), 1M Tris-HCL 10%SDS, 10% Ammonium Persulfate (10%APS), TEMED, ddH2O. Bahan bahan ini sudah tersedia dalam bentuk kit sehingga memudahkan anda dalam menyiapkan gel SDS-PAGE. Kit SDS-PAGE gel dapat dilihat pada artikel Katalog Western Blot.

Tips dalam membuat gel SDS-PAGE pastikan pada saat menuang gel pastikan tidak ada gelembung. Setelah menuangkan campuran bahan gel diantara 2 plat kaca kemudian suntikan alkohol absolut untuk menghindari adanya oksigen.

3. Elektroforesis 

Pada tahap Elektroforesis dibutuhkan alat electroporator. Tahapan dari elektroforesis atau SDS-PAGE yaitu sebagai berikut:

3.1 Masukan larutan penyangga atau running buffer pada alat electrophorator.

3.2 Tempatkan gel pada electroporator, dan sambungkan power supply pada sumber listrik. (Tips: selalu pastikan sumber listrik terhubung dengan warna kabel  yang sama, yaitu merah ke merah, hitam ke hitam).

3.3 Pastikan gel terendam seluruhnya oleh larutan penyangga, lepaskan sisir gel dengan perlahan.

3.4 masukkan marker protein target sebanyak 6 μl ke dalam well, kemudian sampel sebanyak 15 μl ke dalam setiap well kosong.

3.5 Jalankan alat dengan tegangan rendah (60V) untuk separating gel dan tegangan tinggi (140V) untuk stacking gel.

3.6 Diamkan selama kurang lebih 1 jam, atau sampai pewarna menuju bagian bawah gel. (Tips: gunakan pewarna Coomassie Brilliant Blue jika konsentrasi protein rendah)

4. Transfer protein pada membran (Electrotransfer)

Transfer protein pada membran ini disebut juga dengan proses blotting. Protein hasil dari SDS-PAGE akan berpindah dari gel poliakrilamid ke membran transfer atau membran adsorben melalui arus listrik. Membran adsorben dikenal juga dengan blotting membran. Terdapat 2 jenis membran blotting yang biasa digunakan oleh peneliti yaitu nitrocellulose dan polyvinylidene fluoride (PVDF). Membran PVDF memiliki sensitivitas lebih tinggi dibandingkan nitrocellulose. Membran PVDF mampu mengikat protein 170-200μg/cm2 sedangkan membran nitrocellulose hanya sekitar 80-100μg/cm2. 

Electrotransfer terdiri dari 2 metode yaitu:

4.1 Blotting semi kering

Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer. Kertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit dengan arus lstrik tertentu.

4.2 Blotting basah

Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan blotting basah seperti susunan sandwich yaitu, Spong, 3 kertas filter, gel SDS-PAGE, blotting membran (PVDF/nitrocellulose), 3 kertas filter dan spong. (Tips: usahakan tidak ada gelembung di antara kertas filter dan gel). Proses Transfer protein ini dapat dilakukan selama 45 menit sampai 90 menit, sesuaikan dengan ketebalan gel. Semakin tebal gel maka proses transfer akan semakin lama. 

5. Blocking dan penempelan antibodi

Proses pemblokiran atau blocking pada western blot adalah hal yang sangat penting, karena menentukan antibodi berikatan dengan protein target. Reagen Blocking yang sering dipakai yaitu 5% bovine serum albumin (BSA) atau reagen berbahan dasar susu yang diencerkan dalam TBST (pencampuran tris-buffered saline dan tween) untuk mengurangi background atau latar belakang. Tahapan dari blocking dan penempelan antibodi yaitu sebagai berikut:

5.1 Block membran transfer dengan 5% BSA atau susu skim dalam TBST selama 1 jam.

5.2 Tambahkan antibodi primer dalam 5% BSA dan diamkan semalaman dalam pada alat shaker dengan suhu 4℃ .

5.3 Cuci membran dengan TBST, dan lakukan sebanyak 3 kali. (Tips proses pencucian dan inkubasi antibodi harus terus di aduk dalam suhu kamar)

5.4 Tambahkan antibodi sekunder dalam 5% BSA/susu skim dan TBST dan inkubasi 1 jam.

5.5. Cuci membran selama 5 menit, sebanyak 3 kali.

5.6 Tambahkan ECL pada membran dan diamkan selama 1-2 menit. (usahakan ECL menutupi atas dan bawah membran.

5.7 Lihat hasil dalam ruang gelap, jika latar belakang terlalu kuat, kurangi waktu terpaparnya dengan cahaya).

3. Penanganan masalah atau Troubleshooting pada Western Blot

Walaupun proses Western blot sederhana, namun sering kali dijumpai hasil yang tidak diharapkan misalnya, muncul pita yang tidak terduga, pita tidak muncul, pita terlihat samar, blot (titik) yang terbentuk tidak rata. 

1. Pita tidak terduga

Munculnya pita yang tidak terduga atau tidak biasa dapat disebabkan adanya proses degradasi protease. Penanganannya yaitu, sampel diganting dengan sampel yang segar atau ganti antibodi.

2. Pita tidak muncul atau negatif 

Pita tidak muncul dapat disebabkan karena terlalu banyak konsentrasi protein atau antibodi. Perlu ketelitian dalam menentukan konsentrasi protein atau antibodi.

3. Pita terlihat samar

Pita yang muncul terlihat samar atau kabur sering kali disebabkan oleh tegangan tinggi atau adanya gelembung udara selama proses transfer. Perlu diperhatikan penggunaan gel sesuai kekuatan tegangannya dan urutan sandwich membran jangan sampai tertukar. Dapat juga ditangani dengan mengganti larutan penyangganya.

4. Titik atau blot tidak rata

Titik atau blot tidak rata dapat disebabkan karena adanya pergerakan molekul yang terlalu cepat pada gel, akibat resistensi yang rendah. Hal ini dapat diatasi dengan mengoptimalkan gel agar sesuai dengan sampel.

Masalah lainnya yang dapat terjadi pada hasil western blot yaitu tidak cocoknya antibodi yang digunakan karena tidak semua antibodi dapat diaplikasikan untuk western blot. Selain itu proses pencucian dalam waktu lama dapat menurunkan sinyal. Buffer dan reagen lainnya juga dapat menimbulkan masalah apabila ditemukan adanya kontaminasi antar reagen. Misalnya jika buffer terkontaminasi dengan natrium azida maka dapat menonaktifkan HRP.

Buffer dan reagen lainnya untuk western blot dengan kualitas baik dapat anda dapatkan di Indogen. Daftar produk untuk western blot dapat anda lihat pada artikel sebelumnya dengan judul Katalog Reagen Western Blot.

Sekiranya ada pertanyaan atau produk yang anda cari tidak terdapat pada daftar tersebut. Kami dengan senang hati akan membantu anda. Silahkan kontak kami via email atau WA.

Referensi:

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/#:~:text=Western%20blot%20uses%20two%20different,form%20thin%2C%20sharply%20defined%20bands 

Subscribe to receive free email updates: