WA. 0812-9318-5185 | Protokol Kit Imunohistokimia (IHK)

Imunohistokimia adalah suatu teknik pemeriksaan jaringan untuk mengetahui antigen-antibodi spesifik yang dilakukan oleh para ahli patofisiologi. Pengerjaan Imunohistokimia tidaklah cepat dan bahan-bahan atau reagen nya sangat banyak. 

Pemeriksaan imunohistokimia biasanya dilakukan di laboratorium histologi baik pada sekolah kedokteran maupun rumah sakit. Kali ini akan dibahas bagaimana pengerjaan imunohistokimia (IHK) menggunakan perangkat kit yaitu Immunohistochemistry Kit. Penggunaan Imunohistokimia Kit diharapkan dapat memberikan solusi sehingga pengujian dan pemeriksaan IHK dapat lebih cepat dan efisien.

Berikut adalah Protokol yang terdapat dalam kit imunohistokimia salah satu produk Kit dari INDOGEN dengan merk Elabscience.

1. Instrument dan alat

Pipet, Pulpen khusus imunohistokimia, Microwave atau panci presto, timer, wadah untuk inkubasi, gelas objek, cover slide, mikroskop, botol dan lain-lain.

 

2. Persiapan larutan

• Siapkan PBS

• Siapkan Larutan EDTA antigen repair, dan pewarna DAB sesuai instruksi pada manual

3. Suhu yang disiapkan

Suhu pengerjaan pada 15-28℃

4. Langkah Kerja

1. Deparafinasi dan rehidrasi

1. Perendaman preparat dengan xylol selama 10 menit, diulang 2 kali.

2. Bersihkan preparat dari kelebihan cairan, kemudian rendam dalam alkohol absolut selama 3 menit, 2 kali pengulangan.

3. Bersihkan preparat dari kelebihan cairan, rendam preparat dalam alkohol 95% selama 3 menit.

4. Bersihkan preparat dari kelebihan cairan, rendam preparat dalam alkohol 80% selama 3 menit.

5. Cuci preparat dengan deionized water selama 1 menit.

6. Cuci preparat dengan PBS selama 3 menit, diulang 3 kali.

2. Antigen Retrieval 

1. Setelah tahap deparafinasi dan rehidrasi, preparat dimasukan dalam dalam frame plastik tahan panas kemudian letakan pada wadah inkubasi (gelas). Masukan larutan Reagen 1 berisi antigen repair EDTA 1x (diencerkan 20x dengan aquades) ke dalam wadah inkubasi. Pastikan sampel pada preparat terendam.

2. Kemudian masukan wadah yang berisi larutan dan preparat ke dalam microwave dengan suhu tinggi sampai mendidih, kemudian atur di suhu sedang sampai 20 menit, pastikan preparat terendam.

3. Keluarkan wadah dari microwave kemudian buang sedikit larutan antigen repair dan didinginkan dengan air dingin

4. Setelah dingin atau dalam suhu ruang, cuci preparat dengan PBS (pH7.4) selama 3 menit, 3 kali pengulangan.

Catatan: selama proses reparasi antigen, pastikan preparat terendam oleh larutan antigen repair. Larutan antigen repair yang dibuang perkiraan 800 mL/1 frame -1500 mL/3 frame. Ketika mencuci preparat dengan PBS, usahakan tidak mengenai jaringan langsung.

3. Inaktivasi Enzim Peroksida dalam sel

1. Keringkan preparat dengan kertas absorbent dan buat keliling di sekitar jaringan menggunakan pulen imunohistokimia.

2. Tambahkan H2O2 3% (Reagen 2) sebanyak 100 μL ke dalam preparat untuk inaktivasi peroksida dalam sel, kemudian inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.

3. Cuci preparat dengan PBS selama 3 menit, 3 kali pengulangan.

4. Pemblokan

Keringkan preparat dengan Kertas absorbent. Tambahkan normal serum kambing (Reagent 3), inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pemblokan ini untuk menghindari pewarnaan nonspesifik.

 

5. Inkubasi Antibodi Primer

1. Keringkan preparat dengan kertas absorbent.

2. Tambahkan Reagen 4 sebanyak 100 μL pada preparat sebagai kontrol negatif, kemudian ganti PBS dengan antibodi primer pada preparat. Simpan dalam wadah basah dalam suhu ruang selama 1 jam atau dapat juga pada suhu 4℃ semalaman.

6. Hangatkan ulang

1. Jika preparat disimpan pada suhu 4℃, diamkan dahulu sampai mengikuti suhu ruang, selanjutnya cuci preparat sesuai langkah berikutnya.

2. Cuci preparat dengan PBS selama 3 menit, diulang 3 kali.

7. Pemberian Polymer Helper (Reagent 5)

1. Keringkan Preparat dengan kertas absorbent, kemudian tambahkan Reagent 5 (Polimer Helper), simpan dalam suhu 37℃ selama 20 menit

2. Cuci kembali dengan PBS selama 3 menit, 3 kali pengulangan.

8. Inkubasi Antibodi Sekunder

1. Keringkan kembali preparat, tambahkan Reagent 6 (antibodi sekunder, Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG), simpan dalam suhu 37℃ selama 20 menit.

2. Cuci dengan PBS selama 3 menit, sebanyak 3 kali.

9. Deteksi Sinyal

1. Keringkan preparat dengan kertas absorbent.

2. Tambahkan larutan DAB sebanyak 100 μL (Reagent 7 : Regent 8 = 1:49) ke setiap preparat, inkubasi selama 3-5 menit, amati hasil pewarnaan dengan mikroskop, usahakan jangan sampai warna menjadi sangat gelap.

3. Preparat aliri dengan air untuk menghentikan pewarnaan.

10. Counterstaining

Tambahkan larutan Hematoxylin sebanyak 100 μL (Reagent 9) pada preparat, diamkan selama 30 detik sampai 1 menit. Kemudian preparat dialiri air selama 5 menit.

Catatan: Selama pemberian Hematoxylin, lamanya waktu inkubasi berbeda beda setiap sampel, warna inti sel dari biru terang sampai biru gelap.

11. Dehidrasi dan Perekatan (Mounting)

1. Rendam preparat dalam alkohol 70% selama 2 menit.

2. Rendam preparat dalam alkohol 80% selama 2 menit.

3. Rendam preparat dalam alkohol 90% selama 2 menit.

4. Rendam preparat dalam alkohol absolut selama 2 menit, 2 kali pengulangan.

5. Rendam preparat dalam xylol selama 2 menit, 2 kali pengulangan.

6. Teteskan minyak imersi pada jaringan, kemudian tutup dengan cover glass. 

12. Penentuan Hasil

1. Hasil imunohistokimia perlu diamati dan pastikan dengan mikroskop. Hasil pewarnaanya harus dibandingkan dengan kontrol positif untuk hasil positif dan bandingkan kontrol negatif dengan hasil yang negatif. Hasil dari semua percobaan harus ada yang positif dan negatif. Hasil negatif ditunjukan dengan tidak tidak adanya warna coklat pada sampel.

Catatan: setiap proses pemeriksaan imunohistokimia harus ada kontrol positif dan negatif agar hasil dapat dipercaya keakuratannya.

2. Preparat yang menunjukkan hasil positif sesuai kontrol positifnya, menandakan bahwa pada jaringan tersebut terdapat antigen target.

3. Apabila hasil imunohistokimia sudah sesuai positif dan negatif kontrolnya, namun hasil preparat ujinya tidak menunjukan hasil positif kemungkinan antigen target dalam jaringan sangat rendah.

4. Apabila kontrol positif dan negatif menunjukkan hasil yang negatif semua, maka sudah dipastikan pengerjaan dan reagennya salah dan harus diulang kembali pemeriksaannya secara tepat.

Untuk Produk Kit Imunohistokimia dapat dilihat pada artikel Reagen dan Kit untuk Penelitian Imunohistokimia.

 

Subscribe to receive free email updates: